背景：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包含O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase，二者均是重要的糖基化研究的工具酶，組合用于糖蛋白O-連糖鏈的酶切釋放。Rhinogen^? O-Glycosidase能夠將糖蛋白中Ser或Thr殘基的羥基連接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-連雙糖釋放下來，如圖1。核心結構的任何修飾都可以阻斷O-Glycosidase的作用，最常見的修飾是核心結構的單、二或三唾液酸化。Rhinogen^? α2-3,6,8,9 Neuraminidase能夠釋放O-連糖鏈非還原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸殘基，如圖2，不同唾液酸殘基的釋放速率大致為α (2,6)-＞α (2,3)- ＞α (2,8)- ＞α (2,9)-。唾液酸酶的這種組合模式使得O-連糖鏈的酶切釋放更徹底。該Kit包含的所有酶及試劑均與下游HPLC及MS兼容。

圖1. O-Glycosidase與α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用于糖蛋白O-連糖鏈的酶切釋放

圖2. Rhinogen^? α2-3,6,8,9 Neuraminidase作用位點

包裝規格：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包裝規格如下：

配套試劑：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)提供的配套試劑如下：

產品來源：

       本試劑盒中的所有酶都是大腸桿菌BL21中表達并分離純化的重組酶：O-Glycosidase基因來源于Enterococcus Faecalis，分子量為147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因來源于Arthrobacter ureafaciens，分子量為66KDa。

產品質量：

       SDS-PAGE分析，純度≥95%；沒有檢測到污染的糖苷外切酶、糖苷內切酶及蛋白酶活性。

酶活定義：

       1個O-Glycosidase酶活力單位定義：在100 μl反應體系中，37°C，pH7.5條件下，1小時內從5mg唾液酸酶消化后的非變性fetuin 上催化釋放0.68nmol O-連二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^? O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

       1個α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力單位定義：在37°C，pH5.5條件下，以對硝基苯基-α-D-N-乙酰神經氨酸為底物，1分鐘內催化釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^? α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^? Sialidase ATM。

儲存條件： 

       -20°C。

產品特點：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具有穩定性高、比活性高等特點，是兩種高度純化和非常穩定的糖苷酶的組合，適用于蛋白質組學及糖生物學研究中糖蛋白上常見O-連聚糖的有效釋放。

1. 高純度：沒有污染蛋白酶/其它糖苷酶，純度≥95％；

2. 高穩定性：每批Kit試劑盒中酶及試劑都經過嚴格的質量控制，以實現高穩定性；

3. 高比活性：有效釋放糖蛋白上唾液酸修飾O-連聚糖；

4. HPLC、MS兼容：試劑盒中所有的酶及試劑與下游HPLC及MS兼容。

應用：

1. 聚糖結構分析;

2. 結合位點及功能分析;

3. 治療性糖蛋白的表征及質量控制;

4. 蛋白質組學分析，消除糖蛋白的異質性。

使用建議：

       變性條件下去糖基化方案：

1. 取10-100μg糖蛋白溶液，加入1μl 10×Denaturing緩沖液，補加純化水使得反應體系為10μl；

2. 將上述10μl體系100℃處理10min，使糖蛋白完全變性；

3. 室溫冷卻5min；

4. 在上述變性體系中，分別加入2μl 10×Glyco緩沖液2、2μl 10% NP-40溶液、1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體積為50μl，輕柔混勻；

5. 37°C 條件下反應1-5hr；

注意：對于不同的糖蛋白樣品，需要實驗摸索最適的酶濃度及反應時間。

       非變性條件下去糖基化方案：

1. 取10-100μg糖蛋白底物溶液，加入2μl 10×Glyco緩沖液2、純化水及1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，使得總反應體積為20μl，輕柔混勻；

2. 37°C 條件下反應1-4hr。

注意：通常情況下，糖蛋白變性與否不顯著影響O-連糖鏈去除的效率，但也不排除個例，建議根據自己的底物特性，選擇合適的方法。

當對天然糖蛋白去糖基化時，建議將等量糖蛋白樣品進行變性后再同步進行酶切作為陽性對照，以確定非變性條件下去糖基化反應的程度。

操作說明：

1. 上述操作方法旨在為Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)作為去糖基化試劑操作的一般指南，對于不同的糖蛋白樣品，去糖基化活性高度依賴于反應條件，建議進行適當優化或根據經驗確定最優的操作方法；

2. 去糖基化體系可以線性放大或縮小；

3. 由于變性緩沖液中含有SDS，而SDS會抑制Rhinogen^? O-Glycosidase的活性，因此在變性糖蛋白反應體系中需加入終濃度為1%的NP-40，其能有效解除SDS對O-Glycosidase酶活的抑制；

4. 本產品適用于天然或者變性糖蛋白，對于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更長的反應時間；

5. EDTA、對氯丙基苯磺酸、Mn²⁺、Zn²⁺對O-Glycosidase的酶活有一定的抑制作用，1mM各物質存在條件下，酶活回收率分別為63%、60%、44%、66%%；

6. 本產品僅供研究使用，不適用于人或動的物診斷及治療用途。