背景：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包含去除所有N-連和相對簡單O-連聚糖所需要的酶及試劑。其中的酶試劑是三種糖苷酶的混合物，包括PNGase F、O-Glycosidase、α2-3.6.8.9Neuraminidase。該試劑盒包含的所有酶及試劑均與下游HPLC及MS兼容。PNGase F是從糖蛋白中特異性除去N-連聚糖的糖苷內切酶，能夠將絕大多數N-糖鏈（除最內測GlcNac上連有α-1,3巖藻糖殘基，常見于植物及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分子上釋放下來，可以在N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和復雜寡糖部分最內側的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1。

圖1. PNGase F可以從糖蛋白或糖肽上切割釋放幾乎所有類型的N-連糖鏈

       但是對于O-連聚糖，由于沒有一種像PNGase F的“通用”糖苷內切酶，必須通過一系列糖苷酶除去單糖。Rhinogen^? O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用于糖蛋白唾液酸修飾的O-連糖鏈的酶切釋放，Rhinogen^?α2-3,6,8,9 Neuraminidase能夠釋放O-連糖鏈非還原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸殘基。在去除末端唾液酸殘基的修飾后，Rhinogen^? O-Glycosidase能夠將糖蛋白中Ser或Thr殘基的羥基連接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-連雙糖釋放下來，如圖2。

圖2. Rhinogen^? O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase組合用于常見二或三唾液酸修飾的O-連糖鏈的酶切釋放

包裝規格：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包裝規格如下：

配套試劑：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)配套提供的試劑如下：

       本試劑盒中的所有酶都是大腸桿菌BL21中表達并分離純化的重組酶：PNGase F 基因來源于Flavobacterium meningsepticum，分子量為36kDa；O-Glycosidase基因來源于Enterococcus Faecalis，分子量為147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因來源于Arthrobacter ureafaciens，分子量為66KDa。

產品質量：

       SDS-PAGE分析，純度≥95%；沒有檢測到污染的外切糖苷酶、內切糖苷酶及蛋白酶活性。

酶活定義：

      1個PNGase F酶活力單位定義：在10 μl反應體系中，37°C，pH7.5條件下，1小時內催化釋放10μg變性RNase B＞95%N-連寡糖所需要的酶量。1U Rhinogen^? PNGase F=1 unit NEB PNGase F。

      1個O-Glycosidase酶活力單位定義：在100 μl反應體系中，37°C，pH7.5條件下，1小時內從5mg唾液酸酶消化后的非變性fetuin 上催化釋放0.68nmol O-連二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^? O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

      1個α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力單位定義：在37°C，pH5.5條件下，以對硝基苯基-α-D-N-乙酰神經氨酸為底物，1分鐘內催化釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^? α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^? Sialidase ATM。

儲存條件：

       采用冰袋運輸，收到產品后請立即將酶置于4℃，嚴禁凍存；配套試劑置于-20℃儲存。本品不含防腐劑，務必確保無菌操作取用，避免污染。

產品特點：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)具有穩定性高、比活性高等特點，是三種高度純化和非常穩定的糖苷內切酶的組合，適用于蛋白質組學及糖生物學研究中糖蛋白上所有N-連聚糖及常見相對簡單O-連聚糖的有效釋放。

       1. 高純度：沒有污染蛋白酶/其它糖苷酶，純度≥95％；

       2. 高穩定性：每批KitⅡ試劑盒中酶及試劑都經過嚴格的質量控制，以實現高穩定性；

       3. 高比活性：有效和完全的釋放所有N-連聚糖及常見O-連聚糖；

       4. HPLC、MS兼容：試劑盒中所有的酶及試劑與下游HPLC及MS兼容。 

應   用：

       1. 聚糖結構分析;

       2. 結合位點及功能分析;

       3. 治療性糖蛋白的表征及質量控制;

       4. 蛋白質組學分析，消除糖蛋白的異質性。

使用建議：

       1、變性條件下去糖基化方案：

       1）取10-100μg糖蛋白溶液，加入3μl 10×Denaturing緩沖液，補加純化水使得反應體系為30μl；

       2）將上述30μl體系100℃處理10min，使糖蛋白完全變性；

       3）室溫冷卻5min；

       4）在上述變性體系中，分別加入5μl 10×Glyco緩沖液2、5μl 10% NP-40溶液、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體積為50μl，輕柔混勻；

       5）37°C 條件下反應1-5hr；

       注意：大多數糖蛋白樣品在37°C 條件下反應1-5hr后能夠被完全去糖基化；然而對于一些復雜的糖蛋白樣品可能需要延長反應時間。

       2、非變性條件下去糖基化方案：

       1）取10-100μg糖蛋白溶液，加入5μl 10×Glyco緩沖液2、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，補加純化水至反應總體積為50μl，輕柔混勻；

       2）37°C 條件下反應4-24hr；

       注意：當對天然糖蛋白去糖基化時，建議將等量糖蛋白樣品進行變性后再同步進行酶切去糖基化實驗作為陽性對照，以確定非變性條件下去糖基化反應的程度。

操作說明：

       1. 上述操作方法旨在為Rhinogen^? Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)作為去糖基化試劑操作的一般指南，對于不同的糖蛋白樣品，去糖基化活性高度依賴于反應條件，建議進行適當優化或根據經驗確定最優的操作方法；

       2. 反應體系可以線性放大或縮小；

       3. 本產品適用于天然或者變性糖蛋白，當變性時，大多數糖蛋白能更有效地去糖基化。對于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更長的反應時間；

       4. 變性及非變性條件下的去糖基化處理方案得到的樣品均與下游質譜兼容；

       5. Fetuin可用作有效的陽性對照。試劑盒提供的Fetuin濃度為10mg/ml；

       6. 本試劑盒不建議用于粘蛋白樣底物（Mucin-like substrates）的去糖基化；

       7. 本產品僅供研究使用，不適用于人或動物診斷或治療用途。