背景：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation Kit Ⅲ(for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)包含去除所有N-連和部分復(fù)雜O-連聚糖所需要的酶及試劑。其中的酶試劑是五種糖苷酶的混合物，包括PNGase F、O-Glycosidase、α2-3.6.8.9Neuraminidase 、β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase。該試劑盒包含的所有酶及試劑均與下游HPLC及MS兼容。PNGase F是從糖蛋白中特異性除去N-連聚糖的糖苷內(nèi)切酶，能夠?qū)⒔^大多數(shù)N-連聚糖（除最內(nèi)測GlcNac上連有α-1,3巖藻糖殘基，常見于植物及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分子上釋放下來，可以在N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)雜寡糖部分最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進(jìn)行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1。

圖1. PNGase F可以從糖蛋白或糖肽上切割釋放幾乎所有類型的N-連糖鏈

       但是對于O-連聚糖，由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣且數(shù)量更多，其需要一系列糖苷酶組合使用從糖鏈末端逐一切除修飾的單糖，α2-3.6.8.9 Neuraminidase釋放所有直鏈或支鏈非還原末端的唾液酸殘基，β1-4 Galactosidase水解寡糖鏈上的β1-4連接的半乳糖殘基，β-N-Acetylhexosaminisase催化聚糖末端β-D-N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖胺殘基的水解，直到將O-連聚糖修剪成Core 1（Gal-GalNAc-O-S / T）或/和Core 3（GlcNAc-GalNAc-O-S / T）結(jié)構(gòu)，然后O-Glycosidase才能酶切釋放Gal-GalNAc或/和GlcNAc-GalNAc核心二糖結(jié)構(gòu)，如圖2。此五種酶的組合不能酶切釋放所有的O-連聚糖，如罕見的α-連接的半乳糖、α-連接的巖藻糖、直接與蛋白質(zhì)O-連接的N-乙酰葡萄糖胺（在核蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)）、直接與蛋白質(zhì)α-連接的N-乙酰半乳糖胺（在粘蛋白中發(fā)現(xiàn)）、直接與蛋白質(zhì)O-連接的巖藻糖及甘露糖等。

圖2. O-連糖鏈的釋放需要通過一系列糖苷酶除去單糖，直到將它們修剪成Core 1（Gal-GalNAc-O-S / T）或/和Core 3（GlcNAc-GalNAc-O-S / T）結(jié)構(gòu)

包裝規(guī)格：

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation Kit Ⅲ (for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)包裝規(guī)格如下：

配套試劑： 

       Rhinogen^? Protein Deglycosylation Kit Ⅲ (for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)配套提供的試劑如下：

產(chǎn)品來源：

       本試劑盒中的所有酶都是大腸桿菌BL21中表達(dá)并分離純化的重組酶：PNGase F 基因來源于Flavobacterium meningsepticum，分子量為36kDa；O-Glycosidase基因來源于Enterococcus Faecalis，分子量為147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase 基因來源于Arthrobacter ureafaciens，分子量為66KDa；β1-4 Galactosidase基因來源于Streptococcus pneumoniae，分子量為94kDa；β-N-Acetylhexosaminisasef 基因來源于Streptomyces plicatus，分子量為55kDa。

產(chǎn)品質(zhì)量：

       SDS-PAGE分析，純度≥95%；沒有檢測到污染的糖苷外切酶、糖苷內(nèi)切酶及蛋白酶活性。

儲存條件：

       采用冰袋運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后請立即將酶置于4℃，嚴(yán)禁凍存；配套試劑置于-20℃儲存。本品不含防腐劑，務(wù)必確保無菌操作取用，避免污染。

應(yīng)用：

       1. 聚糖結(jié)構(gòu)分析；

       2. 結(jié)合位點(diǎn)及功能分析；

       3. 治療性糖蛋白的表征及質(zhì)量控制；

       4. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析，消除糖蛋白的異質(zhì)性。

使用建議：

       變性條件下去糖基化方案：

       1. 取10-100μg糖蛋白溶液，加入3μl 10×Denaturing緩沖液，補(bǔ)加純化水使得反應(yīng)體系為30μl；

       2. 將上述30μl體系100℃處理10min，使糖蛋白完全變性；

       3. 室溫冷卻5min；

       4. 在上述變性體系中，分別加入5μl 10×Glyco緩沖液2、5μl 10% NP-40溶液、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase、β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase，補(bǔ)加純化水至反應(yīng)總體積為50μl，輕柔混勻；

       5. 37°C 條件下反應(yīng)1-5hr；

       注意：大多數(shù)糖蛋白樣品在37°C 條件下反應(yīng)1-5hr后能夠被完全去糖基化；然而對于一些復(fù)雜的糖蛋白樣品可能需要更長的反應(yīng)時(shí)間。

       非變性條件下去糖基化方案：

       1. 取10-100μg糖蛋白溶液，加入5μl 10×Glyco緩沖液2、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase、1-2μl β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase，補(bǔ)加純化水至反應(yīng)總體積為50μl，輕柔混勻；

       2. 37°C 條件下反應(yīng)4-24hr；

       注意：當(dāng)對天然糖蛋白去糖基化時(shí)，建議將等量糖蛋白樣品進(jìn)行變性后再同步進(jìn)行酶切去糖基化實(shí)驗(yàn)，作為陽性對照，以確定非變性條件下去糖基化反應(yīng)的程度。

操作說明：

       1. 上述操作方法旨在為Rhinogen^? Protein Deglycosylation Kit Ⅲ 作為去糖基化試劑操作的一般指南，對于不同的糖蛋白樣品，去糖基化活性高度依賴于反應(yīng)條件，建議進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定最優(yōu)的操作方法；

       2. 反應(yīng)體系可以線性放大或縮小；

       3. 本產(chǎn)品適用于天然或者變性糖蛋白，當(dāng)變性時(shí)，大多數(shù)糖蛋白能更有效地去糖基化。對于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更長的反應(yīng)時(shí)間；

       4. 變性及非變性條件下的去糖基化處理方案得到的樣品均與下游質(zhì)譜兼容；

       5. Fetuin可用作有效的陽性對照。試劑盒提供的Fetuin濃度為10mg/ml；

       6. 本試劑盒不建議用于粘蛋白樣底物（Mucin-like substrates）的去糖基化；

       7. 本產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人或動物診斷或治療用途。