背景:
目前越來(lái)越多的抗體和抗體融合蛋白被用作生物治療劑,這些生物治療劑的性質(zhì)又顯著受其糖基化狀態(tài)的影響。例如,重組促紅細(xì)胞生成素的藥代動(dòng)力學(xué)和效力受其糖基化狀態(tài)的嚴(yán)重影響, IgG的Fc區(qū)Asn297處的保守N-連聚糖對(duì)其功能活性至關(guān)重要。此外,一些抗體還具有額外的N-連聚糖,如圖A,其與Fc區(qū)Asn297處的保守N-聚糖一起影響抗體的識(shí)別、半衰期和免疫應(yīng)答反應(yīng)。然而在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的各種變量都可能會(huì)導(dǎo)致抗體糖基化程度的改變及增加其聚糖多樣性,因此在生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)抗體的糖基化狀態(tài)對(duì)于獲得正確的糖蛋白形式至關(guān)重要。
Rhinogen?提供的QuickTM PNGase F-Plus 是一種改進(jìn)的重組試劑,具有快速高效及保留完整的去糖基化蛋白(非還原條件下)的特性,適用于治療性單克隆抗體的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制過(guò)程中N-連糖鏈的分析及蛋白質(zhì)組學(xué)分析。快速處理時(shí)間降低了通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PNGase F長(zhǎng)時(shí)間酶促去糖基化反應(yīng)方案可能引入的雜質(zhì)和不需要的蛋白質(zhì)修飾(氧化,脫酰胺)的風(fēng)險(xiǎn)。
產(chǎn)品包裝:
Rhinogen? QuickTM PNGase F-Plus包裝規(guī)格如下:
目錄號(hào) |
規(guī)格 |
QPF-019-A |
30T |
QPF-019-B |
5*30T |
產(chǎn)品來(lái)源:
Rhinogen? QuickTM PNGase F-Plus是由大腸桿菌表達(dá)得到的重組糖苷酶,分子量大小為36kDa。
產(chǎn)品質(zhì)量:
通過(guò)SDS-PAGE分析,純度≥95%;沒(méi)有檢測(cè)到污染的外切糖苷酶、糖苷內(nèi)切酶及蛋白酶活性。
產(chǎn)品特性:
熱失活條件:75℃處理10min。
產(chǎn)品特點(diǎn):
高 效:快速、無(wú)偏好釋放N-連聚糖;
高 純 度:沒(méi)有污染蛋白酶/糖苷酶,純度≥95%;
高適用性:對(duì)多種結(jié)構(gòu)抗體或糖蛋白有效;
高穩(wěn)定性:每批QuickTM PNGase F-Plus 產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制,以實(shí)現(xiàn)高
穩(wěn)定性;
保留完整二硫鍵:保留完整的去糖基化蛋白使得蛋白質(zhì)表征更方便,減少偏差
(非還原條件下)。
保藏條件:
采用冰袋運(yùn)輸,收到產(chǎn)品后請(qǐng)立即將酶置于2-8℃條件下儲(chǔ)存,嚴(yán)禁凍存;配套試劑置于-20℃儲(chǔ)存,其中QuickTM 反應(yīng)增強(qiáng)劑凍干粉溶解后,-70℃可儲(chǔ)存一個(gè)月,2~8℃可儲(chǔ)存一周;酶液中不含防腐劑,務(wù)必確保無(wú)菌操作取用,避免污染。
應(yīng)用:
1. 在數(shù)分鐘內(nèi)快速完成抗體或抗體融合蛋白的完全快速去糖基化;
2. 抗體及抗體-融合蛋白生產(chǎn)過(guò)程中糖基化狀態(tài)監(jiān)測(cè);
3. 抗體及抗體-融合蛋白生物治療劑的產(chǎn)品質(zhì)量控制;
4. 蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用及研究。
操作說(shuō)明:
本產(chǎn)品僅供研究使用,不適用于人或動(dòng)物的診斷及治療用途。
利用Rhinogen? QuickTM PNGase F-Plus進(jìn)行抗體及抗體融合蛋白去糖基化后,會(huì)快速完全地釋放出所有N-連寡糖鏈,并在釋放糖鏈的同時(shí)將氨基酸特征序列上的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸殘基。
還原條件下,能在數(shù)分鐘內(nèi)使抗體和相關(guān)的融合蛋白快速完全去糖基化,是治療性單克隆抗體的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制過(guò)程中下游N-聚糖分析和應(yīng)用的理想選擇。非還原條件下,能保持抗體二硫鍵的完整性,獲得完整去糖基化多聚體蛋白(即抗體),是質(zhì)譜研究去糖基化蛋白時(shí)的理想選擇。
抗MBP單克隆抗體是QuickTM PNGase F-Plus的良好對(duì)照底物。
如何檢測(cè)Rhinogen? QuickTM PNGase F-Plus在10分鐘內(nèi)是否完全去糖基化?
對(duì)于單克隆抗體,在去除N-聚糖之后在SDS-PAGE上可以觀察到糖基化抗體與去糖基化抗體在凝膠上位置的變化。如果需要更精確的檢測(cè)是否殘留少量的糖基化抗體,可以采用更敏感的測(cè)定(例如,LS-ESI-TOF)。
是的,制備液相色譜和/或質(zhì)譜的樣品,可以通過(guò)常規(guī)的固相萃取方法如C18和石墨化碳分離N-聚糖;去糖基化蛋白通過(guò)微量透析或微過(guò)濾交換緩沖液后用于質(zhì)譜分析,當(dāng)然您也可以在酸性條件下將QuickTM反應(yīng)增強(qiáng)劑分解成無(wú)干擾的副產(chǎn)物,不會(huì)抑制肽電離。
抑肽酶(10μg/ ml終濃度);芐脒(1mM終濃度);抑胃酶抑制素(10μg/ ml終濃度);亮抑酶肽(1μM終濃度);EGTA(1mM終濃度);EDTA(1mM終濃度)。
Rhinogen? QuickTM PNGase F-Plus反應(yīng)與胰蛋白酶是否兼容?
是兼容的,可以將胰蛋白酶直接加入用QuickTM PNGase F-Plus消化的樣品中。