治療性單克隆抗體屬于IgG類，含有N-連接寡糖。典型的IgG類抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們形成三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，包括兩個(gè)相同的Fab（抗原結(jié)合）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域。Fc 結(jié)構(gòu)域是重鏈的同源二聚體，在Asn-297位置帶有N-糖基化保守位點(diǎn)。Fc結(jié)構(gòu)域與免疫細(xì)胞表面的Fc受體(FcγR)結(jié)合來參與免疫細(xì)胞的募集，并直接啟動(dòng)免疫反應(yīng)，包括吞噬作用、免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞因子對抗原展示靶點(diǎn)的刺激。Fc結(jié)構(gòu)域的糖基化介導(dǎo)與FcγR的相互作用并調(diào)節(jié)抗體依賴性效應(yīng)器功能，包括抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)，其包含激活自然殺傷細(xì)胞以啟動(dòng)癌細(xì)胞的裂解，和補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性（CDC），它涉及靶細(xì)胞裂解的啟動(dòng)和補(bǔ)體途徑的部署。
研究表明，IgG的Asn297的聚糖含有的核心巖藻糖或末端唾液酸會(huì)降低IgG對Fcγ受體的親和力。無論是敲除編碼α1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 (Fut8) 的基因還是過表達(dá)編碼GnT-III轉(zhuǎn)移酶 (Mgat3) 的基因都會(huì)導(dǎo)致Asn297缺乏核心巖藻糖基化，可以提高把IgG對FcγRIIIa 的親和力，從而增強(qiáng)ADCC效應(yīng)。因此單克隆抗體的糖基化修飾分析至關(guān)重要。
從廣義上講，治療性蛋白質(zhì)的糖基化分析可以在三個(gè)水平上進(jìn)行，即完整蛋白質(zhì)、糖肽和釋放的聚糖。
圖片來源Challenges of glycosylation analysis andcontrol: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs
有多種分析方法可在完整蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行表征，包括色譜、電泳、MS和其他光譜技術(shù)。由于卓越的分辨率，MS已成為在開發(fā)過程的許多階段表征 mAb的關(guān)鍵分析工具，質(zhì)譜分析常用的離子化技術(shù)為MALDI和ESI,二者均為軟電離技術(shù)，具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，并兼具高通量、高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，但由于離子化可能引起唾液酸殘基等不穩(wěn)定糖苷鍵的斷裂，分析前需要對糖鏈進(jìn)行(全)甲基化衍生或?qū)ν僖核釟埢M(jìn)行衍生保護(hù)。其中，MALDI是一種快速、簡單的糖鏈離子化方法，對鹽等干擾物的耐受力強(qiáng)，因電離產(chǎn)生的離子多為單電荷而便于解析。另外可以通過高分辨率質(zhì)量分析儀，包括ToF、Orbitrap和傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)儀器來解決小的質(zhì)量差異。
在質(zhì)譜分析過程中，糖肽因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子質(zhì)量大、離子化效率低、殘留多肽干擾而較糖鏈分析更加困難。目前報(bào)道的糖肽分析方法主要有一級(jí)質(zhì)譜（MS1）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS2）。一級(jí)質(zhì)譜水平的糖肽分析：糖肽在MS1水平的直接鑒定依賴于高分辨質(zhì)譜儀采集糖肽精確分子質(zhì)量的同位素分布數(shù)據(jù)。在多肽中，其主要組成元素為C、H、N 等(同位素間均只有1 u差異)。然而，糖肽中含有較多的氧元素，自然界中16O與18O之間存在2 u差異。因此，其特征性的同位素峰型在理論上可以用于糖肽的識(shí)別和鑒定，但對質(zhì)譜儀的性能要求較高。MS2水平的糖肽分析：糖肽的鑒定一般通過串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行確定。常見的串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式有碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、高能碰撞解離（HCD）、電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）。CID碎裂技術(shù)能量較高，糖肽裂解作用于肽鏈上的聚糖，產(chǎn)生一系列與聚糖裂解有關(guān)的碎片離子。然而，因糖肽的分子質(zhì)量較大，CID-MS2圖譜無法檢測到氧鎓離子信號(hào)，不利于糖肽MS2譜圖的解析。
聚糖的釋放可采用生物酶解和化學(xué)水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)、N-糖苷酶A(PNGase A)、糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)和糖苷內(nèi)切酶S(Endo S) 是常用的從蛋白質(zhì)氨基酸鏈上酶解聚糖的糖苷酶。PNGase F可用于糖肽或完整蛋白上連接的聚糖釋放，然后可以利用一系列酶包括：尿素節(jié)桿菌唾液酸酶 (ABS)、牛睪丸β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-巖藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）聯(lián)合作用，根據(jù)外切糖苷酶的特異性，可以將共洗脫的聚糖分開。
為提高檢測的靈敏度，基于HPLC的聚糖分析工作流程通常包括聚糖的熒光標(biāo)記。一些熒光標(biāo)簽已連接到N-聚糖上，例如 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 和 2-氨基苯甲酸 (2-AA)。使用HILIC作為分離模式和使用熒光標(biāo)記的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不同的操作人員可以在不同的系統(tǒng)上進(jìn)行快速且高度可重復(fù)的完成糖鏈分析。糖鏈的分析可從RP-HPLC和CE-LIF平臺(tái)收集的數(shù)據(jù)，專用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫（即Glycobase），以及通過HILIC-HPLC/UPLC分析的大量聚糖種類的歸一化保留時(shí)間值（GU值），再加上外切糖苷酶陣列消化如下圖，可以使結(jié)構(gòu)分配相對簡單。
使用N-聚糖的外切糖苷酶陣列消化確定單糖組成和連接，本實(shí)驗(yàn)中使用的一系列酶包括：尿素節(jié)桿菌唾液酸酶 (ABS)、牛睪丸 β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-巖藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）。根據(jù)外切糖苷酶的特異性，可以將共洗脫的聚糖分開。
蛋白質(zhì)的糖基化是一種重要的翻譯后修飾，糖基化蛋白中的寡糖為非模板合成，并呈復(fù)雜的樹枝狀結(jié)構(gòu)，據(jù)報(bào)道僅由6種單糖組成的寡糖鏈，其理論結(jié)構(gòu)即達(dá)到驚人的1012種。宿主細(xì)胞、生產(chǎn)工藝等各種影響因素更增加了糖基化修飾結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。因此選擇合適的方法及工具酶對蛋白質(zhì)的糖基化修飾進(jìn)行表征尤為關(guān)鍵。
參考文獻(xiàn)
[1]Peiqing, Zhang, Susanto, et al. Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs.[J]. Drug Discovery Today, 2016.
[2]荀超超. 蛋白N-糖鏈核心巖藻糖探針的合成[D].南昌大學(xué),2014.
[3]賴治臻,周巾煜,李智立.免疫球蛋白G糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法及其應(yīng)用[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2021,42(05):878-896.