報告基因法是將報告基因編碼的序列與基因表達序列融合或者與其他目的基因融合形成重組蛋白，通過報告基因產物的表達來顯示目的基因的表達調控。
基于熒光素酶的報告基因與β-半乳糖苷酶 (β-Gal)、葡萄糖醛酸酶 (GUS) 、綠色熒光蛋白 (GFP) 、分泌型堿性磷酸酶 (SEAP) 報告基因具有獨特的優勢，它的優勢在于：
② 內源性低，哺乳動物無內源性表達和其檢測不受細胞內其他物質影響的特點；
③ 無激發光的非特異性干擾，信噪比較高；
④ 檢測范圍廣，大于7個數量級。
圖1。(A)，I型干擾素在用ISRE驅動的熒光素酶穩定轉染的HEK 293細胞中誘導熒光素酶表達。(B)，抗-IL-6/抗-IL-6R mAbs抑制用SIE驅動的熒光素酶穩定轉染的DS-1細胞中IL-6誘導的熒光素酶表達。(C)，抗VEGF/抗VEGFR2 mAb抑制用VEGFR2和NFAT響應性熒光素酶穩定轉染的HEK 293細胞中熒光素酶的表達。(D)，CHO細胞被膜錨定的抗CD3 scFv和PD-L1穩定轉染，而Jurkat細胞被PD-1和NFAT反應性熒光素酶穩定轉染。CHO細胞上的抗 CD3 scFv交聯并激活Jurkat細胞上的CD3，導致NFAT控制的熒光素酶的表達，但CHO細胞上的PD-L1與Jurkat細胞上的PD-1相互作用，抑制熒光素酶的表達，而抗PD-1/anti-PD-L1 mAbs阻斷PD-1和PD-L1相互作用，導致熒光素酶表達抑制的逆轉。(E)，Jukat細胞用FcγRIIIa-FcεRIγ嵌合體和用于mAb的ADCC的NFAT響應熒光素酶穩定轉染。腫瘤抗原之間的相互作用mAbs和Fab以及mAbs的Fc和嵌合體的胞外FcγRIIIa部分有助于嵌合體的交聯，由嵌合體的胞內FcεRIγ部分介導的信號轉導導致NAFT控制的熒光素酶的表達。(F)，H322細胞用與熒光素酶C端融合的Shc蛋白和與熒光素酶N端融合的Grb2蛋白穩定轉染用于抗EGFR mAb。由EGF誘導的EGFR的激活、二聚化和磷酸化依次募集Shc和Grb2，并且這兩種蛋白質的接近重構了熒光素酶，而抗EGFR mAbs消除了由EGF誘導的熒光素酶生物活性。
下面簡單介紹報告基因法檢測抗HER2單克隆抗體ADCC生物學活性的方法構建。
構建FcγRⅢ表達質粒pcDNA3.1-hFcγRⅢa和報告基因質粒pcDNA3.1-NFAT-RE-luc，并轉染Jurkat細胞，接種密度為2.5×105～4×105個·mL-1，2～3d傳代，最高細胞密度不應超過2×106個·mL-1；傳代培養基為RPMI 1640+10%FBS。電轉參數如下：電轉體積為100μL；細胞數目為2×106個·mL-1；質粒用量為10μg；電轉條件為1350V，10ms，3次。電轉后的Jurkat細胞于6孔板培養，每孔培養基為2mL。
效應細胞株的篩選
轉染24h或48h后加入篩選壓力，以G418作為單轉pcDNA3.1-hFcγRⅢa的選擇壓力劑，篩選質量濃度為500μg·mL-1；以嘌呤霉素作為單轉pcDNA3.1-NFAT-RE-luc的選擇壓力劑，篩選質量濃度為1.0μg·mL-1；對于細胞表面的hFcγRⅢa分子，采用流式分析的方法進行克隆鑒定和篩選。200g離心5min收集1×105個細胞，以PBS洗滌1次，200g離心5min后，加入1μg·mL-1FITC標記remicade，4℃孵育1h，再以PBS洗滌3次，每次200g離心5min，最后以200μL PBS重懸細胞進行流式檢測。通過NFAT通路激活因子PMA和離子霉素共刺激的方法檢測NFAT-RE-luc報告基因信號高的克隆，不同克隆每孔加入200μL含有0.1μmol·L-1PMA和1μmol·L-1離子霉素的細胞培養基(含10%FBS的RPMI 1640培養基)刺激過夜，以僅加200μL細胞培養基的細胞孔作為陰性對照進行熒光信號比較篩選。
靶細胞的選擇
流式細胞術檢測人乳腺癌細胞系SKBR3、BT474及MCF7表面HER2表達量差異，經FlowJo7.2.5軟件分析可知，這3株細胞表面HER2蛋白的表達量高低為SKBR3>BT474>MCF7。ADCC試驗成功的重要條件之一就是特異的HER2+靶細胞，在這幾個HER2+細胞株中，SKBR3和BT474表面均高表達HER2抗原，明顯優于MCF7。
抗體濃度范圍選擇、效靶比的選擇、誘導時間的選擇
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基于保證劑量效應四參數曲線平臺及保證誘導效果的考慮，最終選擇起始稀釋工作濃度為4000ng·mL-1，1∶4梯度稀釋作為檢測抗HER2單抗ADCC生物學活性時的試驗方案。從不同效靶比得到的不同ADCC試驗FI值并結合考慮EC50值，效靶比為15∶1時能有效誘導ADCC活性并得到最大的FI值。ADCC誘導倍數隨著不同誘導時間變化明顯，當誘導時間為20和24h時可得到較大誘導倍數，考慮到工作效率等因素，選擇誘導時間為20h。
方法應用
以原研HER2單抗為參比品，選取不同類型的抗HER2單抗1、單抗2，運用選定的報告基因法，分別進行ADCC活性測定。單抗1作用于HER2胞外的第2個結構域，主要通過阻斷HER2的二聚化發揮其抗腫瘤效應。單抗2是針對HER2靶點的新型抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugates,ADC)，其不僅具有原研抗HER2單抗類似的生物學活性，還能通過其偶聯的化學藥物的釋放特異性地殺傷腫瘤細胞。從實驗結果看出，不同類型的HER2單抗在本實驗中均呈現較好的劑量效應曲線，說明本方法可應用于不同類型HER2靶點單抗ADCC效應的檢測與比較。
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參考文獻
[1] Wang, L. , Yu, C. , & Wang, J. . (2019). Development of reporter gene assays to determine the bioactivity of biopharmaceuticals. Biotechnology Advances, 107466.
[2] 劉春雨等. "基于報告基因的抗HER2單克隆抗體ADCC生物學活性測定方法的建立及應用." 藥物分析雜志 39.1(2019):11.