隨著基因工程、分子生物學(xué)和基因組學(xué)的研究發(fā)展，生物技術(shù)藥物也迅速發(fā)展起來。抗體藥物已經(jīng)成為發(fā)展最快的治療性藥物。抗體是由Fab片段和Fc片段兩個部分組成。Fab片段與抗原結(jié)合發(fā)揮作用，F(xiàn)c片段通過與免疫細(xì)胞上表達(dá)的FcγR相互作用，從而激活效應(yīng)細(xì)胞的吞噬作用和補(bǔ)體效應(yīng)等多種免疫途徑，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。除免疫檢查點(diǎn)靶向外，ADCC、ADCP和CDC是抗體介導(dǎo)免疫治療的重要機(jī)制（如下圖）。對于ADCC和ADCP，在結(jié)合靶抗原后，抗體的Fc段募集FcγR表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞，包括NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)釋放細(xì)胞毒性顆粒和吞噬作用以增強(qiáng)變異細(xì)胞的清除。對于CDC，一旦抗體的Fc部分與C1q結(jié)合，一系列補(bǔ)體就會被激活并產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合物(MAC)，該復(fù)合物可以通過破壞細(xì)胞膜來殺死靶細(xì)胞。
傳統(tǒng)的依賴于NK細(xì)胞毒性ADCC檢測過程分為三個重要組成部分：單抗藥物、效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞。因此，體外實(shí)驗(yàn)一般包括靶細(xì)胞的確定（細(xì)胞表面高表達(dá)單抗可識別抗原）、效應(yīng)細(xì)胞的選擇和靶細(xì)胞活性的檢測。
1、效應(yīng)細(xì)胞
眾所周知，ADCC/ADCP 主要由NK細(xì)胞驅(qū)動。因此，傳統(tǒng)的ADCC/ADCP的檢測會使用原代NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞檢測靶細(xì)胞的殺傷或者吞噬效應(yīng)。原始的NK細(xì)胞需要單獨(dú)或者從人血液中分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物中獲取，原代細(xì)胞被認(rèn)為最接近生理環(huán)境，但基于它們的測定容易出現(xiàn)供體間的變異以及自身變異，從而導(dǎo)致ADCC的檢測重復(fù)性差。
2、靶細(xì)胞
通常會選擇腫瘤細(xì)胞或者過表達(dá)靶點(diǎn)的細(xì)胞系作為靶細(xì)胞。
3、檢測方法
（1）將具有放射性的鉻51與靶細(xì)胞孵育，鉻51會進(jìn)入靶細(xì)胞；洗去多于未進(jìn)入細(xì)胞的鉻51，再將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞以及抗體共同孵育。如果靶細(xì)胞被殺傷，鉻51就會被釋放出來，檢測溶液中的放射性同位素含量即可確認(rèn)靶細(xì)胞被殺傷的情況。該方法是ADCC檢測靶細(xì)胞被殺傷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而因?yàn)閹в蟹派湫栽亍①M(fèi)時費(fèi)力且實(shí)驗(yàn)變化性大而較少使用。（2）靶細(xì)胞被殺傷后細(xì)胞膜破損，靶細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶（LDH）或蛋白酶（Protease）會釋放到上清液中，可以通過定量檢測這些物質(zhì)的含量來評估靶細(xì)胞被殺傷的程度。現(xiàn)有的檢測乳酸脫氫酶的方法有比色法、熒光法和生物發(fā)光法等。（3）選擇一種染料標(biāo)記靶細(xì)胞（例如，CFSE），另一種染料標(biāo)記死細(xì)胞（例如，F(xiàn)VD），利用流式細(xì)胞儀來定量死亡的靶細(xì)胞（兩種染料均發(fā)光）的含量，從而評估靶細(xì)胞的殺傷能力。
近些年，隨著基因工程的發(fā)展，報告基因法逐漸應(yīng)用于抗體藥物的生物學(xué)活性檢測，下面表格中列舉了報告基因法在生物藥活性檢測方面的應(yīng)用。
報告基因法是利用分子生物學(xué)手段，將報告基因整合到待檢測的細(xì)胞中，通過檢測報告基因產(chǎn)生的信號來研究特定的生物學(xué)過程。抗體藥物發(fā)揮作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答，這個過程中涉及特定信號通路的活化和傳導(dǎo)，利用報告基因法則可以通過報告基因信號的分析，從而間接測定抗體藥的生物學(xué)活性。
1、檢測細(xì)胞的選擇
為了構(gòu)建穩(wěn)定性高的方法，檢測所用細(xì)胞一般選用能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系或細(xì)胞株，以方便報告基因的轉(zhuǎn)基因操作和細(xì)胞的克隆化。由原代細(xì)胞或不穩(wěn)定的細(xì)胞系構(gòu)建的報告細(xì)胞，無法保證本次檢測時細(xì)胞的狀態(tài)一致，也就無法準(zhǔn)確、定量地反映待測藥品的質(zhì)量。同時，檢測用細(xì)胞還要盡量考慮是待測藥物的靶細(xì)胞，藥物刺激與靶細(xì)胞產(chǎn)生的變化相關(guān)，這樣能更加真實(shí)地反映待測藥物的活性，也便于與其他方法進(jìn)行比較。
2、報告基因的選擇
報告基因是編碼基因，其編碼產(chǎn)物可以是某些蛋白或酶類。選擇報告基因的原則，一是要考慮報告基因的表達(dá)是否對宿主細(xì)胞有影響，是否有內(nèi)源性活性的干擾；二是要考慮報告基因檢測信號的類型和相應(yīng)的檢測方法是否成熟。常用的報告基因有CAT (氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶) 、SEAP (分泌型堿性磷酸酶) 、GFP (綠色熒光蛋白) 、β-半乳糖苷酶、GUS (葡萄糖醛酸酶) 等。但相對于其他報告基因，螢光素酶具有諸多優(yōu)勢：檢測靈敏度高，如螢火蟲螢光素酶的檢測靈敏度可達(dá)10-20mol，靈敏度約為CAT的100倍，信號半衰期可維持?jǐn)?shù)小時;檢測范圍寬，可達(dá)7～8個數(shù)量級;與β半乳糖苷酶相比，哺乳動物細(xì)胞無內(nèi)源性螢光素酶活性；有多種商品化螢光素酶檢測系統(tǒng)可選。
3、信號通路的選擇
藥物作用于細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生多種效應(yīng)，最終表現(xiàn)可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，或抑制細(xì)胞增殖、產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)或抗病毒效應(yīng)等。在分子層面上, 這些表型的背后勢必涉及多條信號通路的協(xié)同、競爭和整合。因此，應(yīng)盡量選擇與最終細(xì)胞表型相關(guān)、最能反映藥品藥理性質(zhì)的通路。
Rhinogen? ADCC Reporter Bioassay生物發(fā)光報告基因法，基于NFAT（Nuclear factor of activated T-cells）反應(yīng)通路，采用基因工程改造的Jurkat細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FcγRIIIa受體（V158高親和力突變體）和由NFAT應(yīng)答元件驅(qū)動表達(dá)的螢火蟲螢光素酶。抗體通過與效應(yīng)細(xì)胞表面FcγRIIIa的結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)NFAT反應(yīng)元件，NFAT反應(yīng)元件則驅(qū)動螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。利用熒光素酶活性檢測試劑實(shí)現(xiàn)定量分析。
生物學(xué)活性的測定方法多種多樣，而報告基因法因其檢測靈敏度高、檢測周期短、檢測方法干擾少被廣泛用于生物藥的生物學(xué)活性檢測。報告基因法在2015版《中國藥典》被收錄為Ⅰ型干擾素活性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，基于此的生物學(xué)測定方法應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，應(yīng)用前景廣闊。
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