背景:

       支原體（Mycoplasma）是對支原體科、無膽甾原體科和螺原體科的原核微生物總稱，是已知可以自由生活的最小生物，沒有細胞壁，形狀多樣可變，直徑一般是 0.1~0.3μm，基因組A-T 含量高，對常見的抗生素不敏感，對熱敏感。目前已從污水、植物、動物、禽類、昆蟲、人、溫泉或其他高溫環境中發現 200 種左右支原體。
     細胞如果受到支原體污染，細胞生長速度變慢，細胞產生病變或形態改變。連續培養細胞污染的概率大約15~35%，主要來源于 20 多種支原體，包括口腔支原體 （M.orale）、肺炎支原體（M.pneumoniae）、發酵支原體（M.fermentans）、精氨酸支原體（M.arginini）、萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）和豬鼻支原體（M.hyorhinis）。
      人員操作、污染的細胞、原輔料（血清、胰酶、培養基），實驗環境污染（生物安全柜、細胞間，培養箱）、實驗儀器（水浴鍋、液氮罐）、實驗耗材（培養皿、方瓶、細胞工廠）都可能是污染源。污染了的細胞一方面對生產帶來巨大影響，另外如果細胞產品、蛋白產品、病毒類產品受到支原體污染，最終會給患者帶來潛在的健康風險。因此，監管部門要求企業對細胞庫，檢定用細胞和產品進行支原體檢測，從源頭上進行控制，盡早發現，確保放行產品不含支原體。對此，全球各國藥物監管部門也發布了支原體檢測相關指南，檢測方法主要包括熒光染色法、培養法、生化檢測方法和核酸擴增法。 上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高、不能區分支原體種類、需要特殊儀器或所需時間較長。而PCR法操作相對比較簡單便捷，PCR擴增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據擴增片段的大小大致預測至少11種所污染的支原體種屬，也可以對PCR產物進一步測序以確定具體的支原體種屬。

概述:

       Rhinogen^? Myco-Acid ^TM PCR支原體檢測試劑盒是一種通過巢式PCR法（Nested PCR）檢測培養細胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測試劑盒。本支原體檢測試劑盒是利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA片段，從而實現對支原體的高靈敏度特異性檢測的。

圖1. Rhinogen^? Myco-Acid^TM PCR支原體檢測試劑盒的檢測原理圖

      本試劑盒提供了PCR Mix（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Loading Buffer），擴增完畢后可以直接上樣電泳，可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。配套的陽性對照，便于確定PCR檢測是否能正常工作及樣品中是否存在抑制PCR反應的物質。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區（space region）在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區。這個間隔區的DNA序列及長度在支原體各個種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區DNA上設計一對F1/R1引物，用于擴增16S和23S之間的間隔區，這就是巢式PCR的第一輪PCR（1st PCR），用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR（2nd PCR）。通過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。

應用: 

      本試劑盒確定可以擴增的支原體種類及1st PCR和2nd PCR擴增產物長度參考如下表：

試劑包裝: 

       Rhinogen^? Myco-Acid^TM PCR支原體檢測試劑盒包裝規格如下：

      1. 操作簡單：試劑盒提供預混好的試劑，使體系配制操作簡便；
       2. 快速檢出：通過PCR擴增及電泳分析進行支原體檢出只需4-5小時左右；
       3. 靈敏度高：PCR反應非常靈敏，可以擴增目的基因序列超過1000萬倍；
       4. 特異性高：使用巢式PCR反應，提高了檢測特異性。

保藏條件:

       采用冰袋運輸，收到產品后請立即置于-20℃及以下條件下儲存。避免多次反復凍融。